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PCR过程中根据荧光信号有无或强弱 |
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| PCR过程中根据荧光信号有无或强弱 |
| 荧光实寸定量PCR技术：DNA鉴定荧光定量PCR原理是利用Taq DNA聚合酶的5’一3’外切酶活性。在PCR反应系统中加入一个荧光标记的探针，该探针可与引物之间的DNA模板发生特异性杂交，探针的5’端标记荧光染料(如FAM或VIC)．3’端连上非荧光淬灭基团(nonfluoresccnt quencher．NFQ)和楷沟结合物(minor groove binder．MGB)。MGB是人工合成的抗肿瘤抗生素00-1065的—个亚单位的非反应性衍生物，为1，2-=氢-(3H)-p比咯并[3，2-e]引哚．7．羧酸盐(CD-PI)的三聚体(CDP13)．对富含A-T的DNA双螺旋表面的槽沟具有极高的亲和力，因此百T:tE不IIJ[i探针长度的基础上显著提高探针的融链温度(Tm>．DNA鉴定当探针保持完整时，5’端荧光基团发出的荧光信号ai3’端NFQ吸收或抑制(FRET效应)t因而检测不到荧光。随7 PCR反应有效进行，Taq DNA聚合酶从引物3’端开始·随新链延伸沿DNA模板移动，当移S到探针结合的位置时，与模板完全配对的探针逐步被Taq DNA聚合酶的5’一3'4F切活性切割（切口平移效应．）．使探针5’端的荧光基团与3’端的淬灭基团分离，FRET效应懈除，荧光基团被激活而发荧光（图4-4）。PCR反应每复制一个特异核酸片段，就有_AI探针被切断，伴随一个荧光信号的释放·故荧光信号的强弱与初k楼板数和扩增循环次数紧密相关。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物是一对一的关系，因此可直接在PCR过程中根据荧光信号有无或强弱，确定扩增产物的有无并实时定量。
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